LAMP: Eine einfache, schnelle und kostengünstige Alternative zur PCR?

Nukleinsäuretests sind zum Standard für den Nachweis von Krankheitserregern in diagnostischen Proben geworden. Ein gängiges Nukleinsäure-Testverfahren, das in Diagnose- und Forschungslabors eingesetzt wird, ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Bei der PCR handelt es sich um ein schrittweises Verfahren, bei dem ein winziges DNA-Fragment so lange vervielfältigt wird, dass es entweder als Bande auf einem Gelstreifen oder als maschinenlesbares Fluoreszenzsignal nachzuweisen ist, und das in wenigen Stunden durchgeführt werden kann. Eine gute PCR erfordert beträchtliche Ausgaben für spezielle Geräte wie Thermocycler, ein spezialisiertes Labor und geschultes und erfahrenes Personal.

Was ist die LAMP-Methode?

Die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) hat sich als einfache, schnelle, sensitive und genaue Methode zum Nachweis und zur Amplifikation von DNA/RNA erwiesen, die keine hochentwickelte Ausrüstung erfordert und relativ kostengünstig ist. Der Test wird in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt. Für den einfachen LAMP-Test werden lediglich ein Pipettierer, Einwegpipetten und ein Trockenbad-Heizblock benötigt. Als Wärmequelle können zwar ein Wasserbad oder ein gewöhnlicher Inkubator oder sogar Thermosflaschen mit heißem Wasser ausreichen, aber zur Erleichterung der Laborhygiene ist ein Trockenbad-Heizblock (Abb. 1) sehr zu empfehlen

Bei einem typischen LAMP-Test enthält das Reagenzröhrchengemisch:

• 6 DNA-Fragmente, so genannte Primer, die mit der nachzuweisenden DNA-Sequenz übereinstimmen
• Spezifisches Polymeraseenzym (z. B. Bst-DNA-Polymerase)
• Puffer
• Unterstützende Reagenzien
• Ein Indikatorfarbstoff (pH-Indikator oder DNA-Direktfarbstoff)
• Reverse Transkriptase für RNA-Viren
• Die zu untersuchende Probe.

Diese Mischung wird 30 Minuten lang bei 60-65 °C inkubiert. Ist in der Probe DNA vorhanden, die zu den Primern passt, werden eine Reihe von hantelförmigen DNA-Schleifen gebildet. Die Schleifen werden mit fortschreitender Amplifikationsreaktion immer komplexer und zahlreicher (Abb. 2).

Bei der Polymerase-Amplifikation entsteht Magnesiumpyrophosphat als Nebenprodukt, das eine Trübung im Röhrchen verursacht. Indikatorfarbstoffe, die direkt an die DNA binden, liefern ein sichtbares Spektrum oder ein UV-fluoreszierendes Signal. Bei einem LAMP-Verfahren wird Phenolrot als pH-Indikator verwendet, der von Rosarot zu Gelb wechselt.

Abbildung 3 zeigt das Ergebnis eines LAMP-Tests für die Afrikanische Schweinepest (ASP). Röhrchen A enthielt einen Extrakt aus der Milz einer Sau, die an ASP gestorben war. Der hohe Gehalt an Virus-DNA führt zu einer undurchsichtigen gelben Farbe. Röhrchen B war eine Speichelprobe, die bei derselben Sau genommen wurde, mit der bei diesem Probentyp erwartbaren geringeren ASP-Viruslast. Die Trübung in den Röhrchen A und B ist an der dunkleren Hintergrundlinie zu erkennen. Die Röhrchen C bis F zeigen verdächtige und negative Proben.

Je nach verfügbarer Technologie gibt es einige Variationen des LAMP-Tests. Der Test kann in versiegelten 96-Well-Mikrotiterplatten mit kolorimetrischen oder fluoreszierenden Farbstoffen oder Trübungsmessungen durchgeführt werden, um ein quantitatives und automatisiertes Ergebnis zu erhalten. Mit gefilterten Fotozellen im Heizblock und einer geeigneten LED könnte auch die halbquantitative Echtzeit-Fluoreszenzmessung in Mikrozentrifugenröhrchen automatisiert werden. Die Spektrophotometrie mit einer Handykamera könnte in einigen Fällen, in denen das menschliche Auge sich nicht ganz sicher ist, Zweifel an fragwürdigen Röhrchen ausräumen.

Der LAMP-Test kann vor Ort durchgeführt werden, um praktische „Point-of-Care“-Ergebnisse bei minimaler Wartezeit zu erhalten. Unser Labor hat kostengünstige LAMP-Tests (von Grund auf und aus Kits) für die Klassische Schweinepest (KSP), das Porzine Circovirus 2 (PCV2) und die ASP (s. oben) entwickelt und verifiziert. Dabei haben wir (für KSP) den Nachweis erbracht, dass man eine Partie Zuchttiere vor der Aufnahme in den Betrieb mithilfe von LAMP-Tests recht kostengünstig auf eine persistente Infektion untersuchen kann.

Die Vorteile von LAMP sind die schnellen Testergebnisse, der minimale Schulungsaufwand, die geringen Investitionen in die Ausrüstung, der geringe Platzbedarf des Labors und die insgesamt niedrigen Kosten pro Probe. Auch wenn die Kosten variieren können, sind die Kosten für einen LAMP-Test im Allgemeinen etwa halb so hoch wie die Kosten für eine PCR, und werden bei einfachen Tests, bei denen keine Extraktion von Nukleinsäure erforderlich ist, noch weiter reduziert. Labors, die in die Entwicklung der LAMP-Methode von Grund auf mit relativ billigen Reagenzien und selbst entwickelten Primer-Sets investieren wollen, können zwar die höheren Kosten eines gebrauchsfertigen Kits vermeiden, müssen aber die mit der Entwicklung, Verifizierung und Zertifizierung verbundenen Kosten tragen.

Die Sensitivität und Spezifität des LAMP-Tests sind mit denen der PCR vergleichbar, und das Verfahren kann innerhalb von 30 Minuten Ergebnisse liefern. Einige Verwaltungen haben kommerzielle LAMP-Testkits für ASP und Covid-19 zugelassen.

Zu den Nachteilen der LAMP-Methode gehören möglicherweise mangelnde Kenntnisse bei einigen Wissenschaftlern und Forschern und eine gewisse Skepsis gegenüber der Methode. LAMP erfordert 6 (bzw. bis zu 8) Primer für jedes nachzuweisende Gen, und die Herstellung von Primern ist schwieriger als bei der herkömmlichen PCR. Dafür es gibt aber Online-Tools. Bei stark mutierenden RNA-Viren wie PRRS kann eine Kombination mehrerer Primer-Sets erforderlich sein, was aber den Nutzen der Methode nicht ausschließt. LAMP erzeugt eine Menge DNA, und die positiven Röhrchen sollten nach dem Test grundsätzlich nicht mehr geöffnet werden, um eine Kontamination des Labors zu vermeiden. LAMP-Amplikons eignen sich nicht ohne weiteres für eine sinnvolle Sequenzierung, und das Labor muss bei LAMP-positiven Proben möglicherweise auf die herkömmliche PCR oder andere Methoden zurückgreifen, wenn Gensequenzen benötigt werden.

Man könnte sich leicht vorstellen, dass LAMP in Viehverkaufshallen, Tiersammelstellen und Schlachthöfen sowie an einfach ausgestatteten und abgelegenen Orten eingesetzt wird, zu denen man keine sensitive und teure Ausrüstung mitnehmen würde. Wo modernere Einrichtungen oder sogar Strom nicht zur Verfügung stehen und binäre Ja/Nein-Antworten für Echtzeit-Entscheidungen an Ort und Stelle unerlässlich sind, könnte LAMP ein gutes Vorgehen bieten. Die geringen Kosten und der fehlende Bedarf an Geräten haben die Verbreitung von LAMP etwas behindert, da Unternehmen und Universitätslabors teure Einrichtungen bevorzugen und der Grenzertrag der Investition wichtiger sein kann als die tatsächlichen Kosten für kostenpflichtige Gesundheitsdienste.

Im Zuge der weltweiten Bemühungen um die Kontrolle und Beseitigung wichtiger endemischer grenzüberschreitender Krankheiten wie der Afrikanischen Schweinepest (ASP), PRRS und der Klassischen Schweinepest (KSP) ist die Verfügbarkeit eines schnellen, praktischen und kostengünstigen Tests von potenziellem Nutzen.

„Vielleicht ist es Wahnsinn, zu praktisch zu sein.“ – Miguel de Cervantes Saavedra (1547-1616), Don Quijote